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克隆感受態(tài)細(xì)胞在操作時(shí)有哪些注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2024-03-20      點(diǎn)擊次數(shù):743
Mach1-T1菌株由野生型non-K-12 E. Coli W菌株改造而來,是目前生長(zhǎng)速度較快的感受態(tài)細(xì)胞之一,在平板上9h可見克隆,缺失核酸內(nèi)切酶 (endA),提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量;重組酶缺陷型 (recA1398)減少插入片段的同源重組概率,保證了插入DNA的穩(wěn)定性;lacZ M15的存在使Mach1-T1可用于藍(lán)、白斑篩選;tonA突變賦予Mach1-T1菌株對(duì)噬菌體T1和T5的抗性。Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>5x108 cfu/μg DNA。
注意事項(xiàng):
1、感受態(tài)細(xì)胞建議在冰中緩慢融化。插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA,不可在冰中放置時(shí)間過長(zhǎng),長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
2、混入目的DNA時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3、轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?;蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
操作說明:
1.Mach1-T1感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,待菌塊融化,加入目的 DNA(質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物)并用手打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打),冰中靜置 25分鐘。
2.42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌2YT或LB培養(yǎng)基,混勻后37℃,200rpm復(fù)蘇60分鐘。
4.5000rpm離心一分鐘收菌,留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。如果進(jìn)行藍(lán)白斑篩選操作,將平板放37℃至少至少13h。

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