TOP-10 Electroporation-Competent Cell 克隆 (電擊) 感受態(tài)細胞

基因型：

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU galKrpsL (Strr)endA1nupG

簡要說明：

TOP-10電擊感受態(tài)細胞只能用于電擊轉化，不能用于熱激轉化。 TOP-10來源于MC1061菌株， 是目前實驗室常用的感受態(tài)細胞之一，基因型與DH10B高度類似 (DH10B為galE15型，而 TOP-10為galU 型)。 TOP-10 生長速度快 (比DH5α快，但比 Mach1-T1生長速度慢)， 10小時可見克隆。 recA1和endA1 的突變有利于插入 DNA 的穩(wěn)定和高純度質粒DNA 的提取。可用于構建克隆，藍白斑篩選等實驗，具有l(wèi)ian霉素抗性。TOP-10電擊感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。

操作說明：

一、0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5分鐘，待其瀝干水分，正置 5分鐘，使乙醇充分揮發(fā)，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實冰面，電極杯頂離冰面 0.5cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置 5分鐘充分降溫。 

二、取-80℃保存的TOP-10電擊感受態(tài)細胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的 DNA (質?；蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP 管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。A. 測定轉化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質粒 pUC19；  B. 對于連接產(chǎn)物，請用乙醇沉淀DNA 后加入適量 TE緩沖液(10mM TrisHCl, pH7.5;1mM EDTA)重懸，DNA 濃度不超過100ng/μl，體積不超過 5μl/50μl 感受態(tài)。 

 三、用200 μl槍頭將感受態(tài)-DNA 混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。 

四、啟動電轉儀，設置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8kV(此為 BioRad 電轉儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉槽中，電擊完成快速插入冰中。  

五、2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入 700 μl不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉移到 50ml 離心管（BD Falcon50ml錐形離心管等），向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至 5ml。37℃，225rpm 復蘇60 分鐘。

六、5000rpm離心一分鐘收菌，重懸后取 100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C 平板上（因菌量較大，若全部涂板請選用直徑 15cm培養(yǎng)皿2-5 個）。將平板倒置放于 37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17 小時。

注意事項：

（一）加入DNA 時體積不應大于感受態(tài)體積的1/10。

（二）電擊感受態(tài)細胞加入電擊杯應避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會增加弧光放電風險。

（三）當DNA 不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時，轉化效率急劇下降。

（四）電擊杯里的離子可增加溶液的電導，增大在含有細胞和DNA 的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風險。 

（五）若轉化大質?；蛳氆@得較高轉化效率，推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍，轉化效率下降一個數(shù)量級。

（六）對于連接產(chǎn)物轉化， 最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mMTrisHCl,pH7.5;1 mMEDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA 濃度不超過 100ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉化效率，增加弧光放電的風險。

（七）混入質粒時應輕柔操作，吸取感受態(tài)細胞時不可用孔徑過小的槍頭 (普通 200ul 槍頭應剪去槍頭尖0.6cm)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細胞膜，降低轉化效率。轉化高濃度的質?；蜻B接產(chǎn)物可相應減少最終用于涂板的菌量。

（八）電擊感受態(tài)細胞最好保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。