基因型

F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA

簡要說明

BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細胞攜帶pLysS質(zhì)粒，具有氯mei素抗性。pLysS含有表達T7 溶jun酶的基因，T7溶jun酶可以作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，能夠降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達，適合表達毒性蛋白和非毒性蛋白。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)（DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細胞由特殊工藝制作經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率高達108cfu/μg。

操作說明

1、取100μl冰上融化的BL21(AI)感受態(tài)細胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

注 意：

 1.Brian Caliendo (Voigt 實驗室)報道過pCP20質(zhì)粒比較難于轉(zhuǎn)化到這個感受態(tài)細胞中，而pCP20轉(zhuǎn)化到其他菌株中都很正常，但是菌體原因未知。

 2.即使不加葡萄糖，BL21(AI) 細胞的araBAD啟動子下游的本底蛋白表達水平仍然很低，加入葡萄糖后能夠進一步的降低本底蛋白的表達水平。

注意事項

1、感受態(tài)細胞最好在冰上融化。

2.混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時間，溫度，IPTG濃度需實驗者優(yōu)化。

建議選擇該菌株進行蛋白表達的條件如下：1.使用T7啟動子載體（高拷貝或者低拷貝都可以）進行蛋白表達。2.使用其他BL21進行蛋白表達時，觀察到明顯的細菌生長的抑制作用。3.表達一個已知的毒性蛋白。